Docente
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IMPERLINI ESTHER
(programma)
Parte teorica (40 ore): - I principi dell’indagine biochimica. - Soluzioni tampone e pH. Ionizzazione di amminoacidi e proteine in funzione del pH. - Teoria degli errori; accuratezza e precisione. - Tecniche di centrifugazione: principi base della sedimentazione; centrifughe e loro uso; rotori; metodi di separazione nella centrifugazione preparativa; centrifugazione differenziale; centrifugazione in gradiente di densità; ultracentrifugazione analitica. - Strategie di purificazione proteica; lisi cellulare ed estrazione proteica; dialisi ed ultrafiltrazione; precipitazione frazionata con sali, con solventi organici, al punto isoelettrico, al calore. - Spettrofotometria: leggi ed applicazioni; legge di Lambert-Beer; gruppi cromofori e spettri di assorbimento di proteine ed acidi nucleici; metodi spettrofotometrici per la determinazione della concentrazione delle proteine: metodo del Biureto, di Lowry e di Bradford; dosaggio enzimatico. - Metodi cromatografici: cromatografia per assorbimento, di ripartizione, di affinità, ad esclusione molecolare, a scambio ionico, di interazione idrofobica, cromatografia liquida a fase inversa, HPLC. - Tecniche elettroforetiche: teoria, leggi, apparati; classificazione dei metodi elettroforetici; elettroforesi di agarosio, acrilammide e SDS-PAGE; tecniche di rivelazione e colorazione dei gel elettroforetici; elettroforesi bidimensionale classica (2-DE) e analisi differenziale su gel (tecnologia DIGE). - Tecniche immunochimiche: western blot; immunoprecipitazione e immunoaffinità come strategie per l’analisi dei complessi proteici e delle interazioni proteiche. - La strumentazione e le principali applicazioni della spettrometria di massa nella moderna proteomica.
Parte pratica (8 ore): - Determinazione della concentrazione proteica di un campione incognito mediante il metodo di Bradford. Visualizzazione allo spettrofotometro dello spettro di assorbimento di una proteina con e senza gruppi prostetici; discussione dei risultati.
- Preparazione di un gel di poliacrilammide in presenza di SDS (SDS-PAGE) e corsa elettroforetica con marcatori di peso molecolare precolorati, così da seguirne la separazione nel corso del processo elettroforetico. Illustrazione degli apparati per la realizzazione di gel di agarosio e/o western blotting.
(testi)
- Bonaccorsi di Patti M. C., Contestabile R., Di Salvo M. L. Metodologie biochimiche. Prima ed., 2012, Casa Editrice Ambrosiana. - De Marco C., Cini C., Principi di metodologia biochimica. Prima ed., 2009, Piccin Nuova Libraria. - Stoppini M., Bellotti V., Biochimica Applicata. Prima ed., 2012, EdiSES. - Reed R., Holmes D., Weyers J., Jones A. Metodologie di base per le scienze biomolecolari. Prima ed., 2002, Zanichelli editore.
Per le attività pratiche di laboratorio vengono fornite dispense dal docente.
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