Colture cellulari animali: cenni storici. Il laboratorio di colture cellulari: generalità sul mantenimento di culture cellulari in laboratorio. Descrizione delle principali attrezzature di un laboratorio di culture cellulari animali. Strumenti e materiale per isolare e crescere culture cellulari. I principali tipi di colture di cellule animali: colture primarie e linee cellulari stabilizzate. Differenze tra colture primarie e linee cellulari. Tecniche di base per colture cellulari immortalizzate in adesione e in sospensione. Tripsinizzazione, conteggio e propagazione di una linea cellulare. Analisi della vitalità cellulare. Tecniche di disinfezione e sterilizzazione. Materiale e metodi di sterilizzazione. Controllo delle contaminazioni. Eliminazione di contaminazioni microbiche in colture cellulari. Norme di sicurezza nel laboratorio di colture cellulari. Tecniche di conservazione delle cellule: la crioconservazione. Sistemi “in vitro” per test di citotossicità.

Transgenesi animale: cenni storici e campi di applicazione. Panoramica sulle strategie di trasferimento genico in cellule animali. Trasformazione mediata da DNA. Tecniche di trasformazione. Trasformazione transiente e trasformazione stabile. I marcatori selezionabili. I geni reporter. Principali sistemi di espressione in cellule animali. Vettori retrovirali. Metodi per la produzione /generazione di topi transgenici. Microiniezione del pronucleo. Trasfezione di embrioni precoci. Trasfezione di cellule ES. Ricombinazione casuale e ricombinazione omologa. “Gene targeting” in cellule ES. Introduzione di piccole mutazioni. Vettori di targeting: inserzione e sostituzione. “Gene targeting”. Il knock out. Il knock in. Selezione positiva-negativa di cellule ES. Impiego di animali transgenici in campo biotecnologico e nella ricerca di base. Clonazione animale.

Interferenza da RNA RNAi. La scoperta della interferenza genica o silenziamento genico a opera di piccoli RNA. siRNA e miRNA. La funzione dei miRNA. La biochimica del silenziamento genico mediato da piccoli RNA. Potenziali applicazioni terapeutiche dell'RNAi.

Analisi di espressione mediante PCR quantitativa (Real Time PCR); differenze tra QPCR ad endpoint e QPCR in real time; chimiche fluorogeniche della real time PCR “specifiche” e “non specifiche”; quantificazione assoluta e quantificazione relativa. Esempi di applicazioni dela real time PCR in ambito zootecnico.

Analisi di espressione genica mediante micro-array. Basi molecolari della tecnologia microarray. Chip a cDNA e chip a oligonucleotidi. Generazione di microarray da banche dati di sequenze con annotazione automatica. Disegno sperimentale con i microarray. Elementi di analisi. Applicazioni diagnostiche. Applicazioni dei microarray: SNP detection arrays – per identificare Single nucleotide polymorphism nel genoma di diverse popolazioni; comparative genomic hybridization (Array CGH) – per identificare riarragiamenti coinvolgenti un numero significtativo di basi; mRNA or gene expression profiling – per studiare I livelli di espressione di migliaia di geni simultaneamente; Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies – per determinare il legame di specifche proteine in porzioni specifiche del DNA (ChIP-on-chip technology).

Sequenziamento del DNA: cenni storici. Nuove tecniche di sequenziamento del DNA. Piattaforme tecnologiche di sequenziamento ultra-massivo per la diagnostica molecolare in vitro (Illumina Solexa, Affymetrix gene-chip, Roche 454, Applied Biosystems Solid, Helicos). Esempi di applicazioni in ambito zootecnico.

Applicazioni pratiche dei marcatori molecolari nelle specie domestiche. Controllo sulle malattie e sicurezza alimentare usando il DNA per la tracciabilità dei prodotti di origine animale, incroci e selezioni migliorate, aumento dell’efficienza della produzione animale, identificazione dell’individuo, identificazione del sesso, accertamento della parentela, identificazione di marcatori genetici associati a geni responsabili di patologie. Utilizzo di marcatori SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) per l’identificazione di polimorfismi in geni candidati associabili a caratteri di interesse per la selezione.

OGM in alimentazione animale. Che cosa è un OGM. Superficie globale delle colture GM. L’industria mangimistica italiana e le varietà GM. Normativa in materia di sicurezza d’uso di piante GM. Valutazione dei rischi per la salute dell'uomo e dell'animale. Tossicità, allergia, antibiotico resistenza. Presenza di frammenti transgenici in tessuti e/o organi. Metodi d’analisi per identificare OGM negli alimenti.

Esercitazioni :
Messa in coltura di una linea cellulare: cellule epiteliali di ghiandola mammaria bovina. Tripsinizzazione e conteggio delle cellule dopo la coltura. Estrazione delle proteine totali cellulari e quantificatione tramite saggio colorimetrico. Estrazione di RNA dalle cellule, quantificazione tramite saggio fluorimetrico dell’RNA estratto, retrotrascrizione dell’RNA. PCR quantitativa (Real Time PCR) per la valutazione dell’espressione genica nelle cellule di ghiandola mammaria bovina.
Le esercitazioni saranno pratiche ed hanno lo scopo di fornire la possibilità a ciascun studente di poter mettere in pratica quanto appreso a lezione nei limiti della strumentazione disponibile e verranno svolte in gruppi di 6-8 studenti nel laboratorio a cui afferisce il docente.

G.L. Mariottini et al. " Introduzione alle colture cellulari", Ed.Tecniche Nuove, 2010.
J. D. Watson, A. A. Caudy, R. M. Myers, J. A. Witkowski “DNA ricombinante«, Zanichelli, 2008.
Barcaccia G. e Falcinelli M. «Genetica e genomica» vol. III, Genomica e biotecnologie genetiche, capitolo 21, pag 1041-1123. Liguori editore.
- Materiale didattico fornito dal docente.