Lezioni frontali (40 ore)
Soluzioni tampone e pH. Ionizzazione di amminoacidi e proteine in funzione del pH. I principi dell’indagine biochimica. Teoria degli errori; accuratezza e precisione. (2 ore)
Centrifugazione. Principi base della sedimentazione. Centrifughe e loro uso. Rotori. Metodi di separazione nella centrifugazione preparativa. Centrifugazione differenziale. Centrifugazione in gradiente di densità. Ultracentrifugazione analitica. (4 ore)
Spettrofotometria: leggi ed applicazioni. Legge di Lambert-Beer. Gruppi cromofori e spettri di assorbimento di proteine ed acidi nucleici. Metodi spettrofotometrici per la determinazione della concentrazione delle proteine: metodo del Biureto, di Lowry e di Bradford. Dosaggio enzimatico. Studi sull'accessibilità dei residui ionizzabili in proteine native. Fluorescenza e fosforescenza. (7 ore)
Strategie per la purificazione di proteine. Estrazione cellulare, dialisi ed ultrafiltrazione. Precipitazione frazionata con sali, con solventi organici, al punto isoelettrico, al calore. (3 ore)
Metodi cromatografici: cromatografia per assorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, per esclusione molecolare, per affinità, per interazione idrofobica, HPLC, gas cromatografia. Efficienza dei procedimenti cromatografici e scelta di un procedimento conveniente. (6 ore)
Tecniche elettroforetiche: teoria, leggi, apparati. Classificazione dei metodi elettroforetici. Elettroforesi in fase libera ed elettroforesi zonale. Elettroforesi su gel. Analisi in condizioni native e denaturanti con applicazioni per la determinazione del peso molecolare di proteine (SDS-PAGE). Western blotting. Isoelettrofocalizzazione per la determinazione del punto isoelettrico di proteine. Elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi di acidi nucleici. Elettroforesi capillare. (5 ore)
Studi sulla struttura delle proteine. Determinazione della composizione amminoacidica, delle cisteine libere, della sequenza amminoacidica di una proteina e localizzazione dei ponti disolfuro. (4 ore)
La strumentazione e le principali applicazioni della spettrometria di massa nella moderna proteomica. (3 ore)
Caratterizzazione strutturale di acidi nucleici. PCR. Sequenziamento del DNA secondo il metodo di Sanger. Southern e Northern blotting (6 ore)

Attività di laboratorio (8 ore)

Determinazione della concentrazione proteica di un campione incognito mediante il metodo di Bradford. Costruzione della retta di taratura sia manualmente su carta millimetrata che con il metodo dei minimi quadrati e confronto dei risultati ottenuti. Visualizzazione allo spettrofotometro dello spettro di assorbimento di una proteina con gruppi prostetici e una senza e discussione dei risultati (4 ore).
Preparazione di un gel di poliacrilammide in presenza di SDS (SDS-PAGE) e corsa elettroforetica con marcatori di peso molecolare precolorati, così da seguirne la separazione nel corso del processo elettroforetico. Illustrazione degli apparati per la realizzazione di gel di agarosio per acidi nucleici e western blotting (4 ore).

Wilson, Walker. Biochimica e Biologia Molecolare. Principi e tecniche. Ottava ed., 2019, Raffaello Cortina Editore.
De Marco C., Cini C., Principi di metodologia biochimica. Prima ed., 2009, Piccin Nuova Libraria.
Bonaccorsi di Patti M. C., Contestabile R., Di Salvo M. L. Metodologie biochimiche. Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine. Seconda ed., 2019, Zanichelli.
Maccarrone M. Metodologie biochimiche e biomolecolari. Prima ed., 2019, Zanichelli

Per le attività pratiche di laboratorio vengono fornite dispense dal docente.
Le slides delle lezioni sono scaricabili all’indirizzo: https://moodle.unitus.it/moodle/course/view.php?id=627
Gli studenti non frequentanti sono incoraggiati a contattare il docente per avere informazioni sul programma, sui materiali didattici e sulle modalità di valutazione del profitto.