Si parte dai principi di base del DNA ricombinante illustrando il funzionamento degli enzimi di restrizione e di modificazione e il clonaggio genico attraverso i sistemi ospite-vettore.
Il meccanismo di funzionamento della PCR standard e quantitativa viene presentato in dettaglio, ma viene data particolare importanza anche alle applicazioni di tali metodologie, attraverso esempi specifici.
Tra i diversi metodi di sequenziamento del DNA, viene esposto solo il metodo di Sanger, sia nella sua versione manuale che automatizzata.
Vengono illustrate le diverse tecniche di analisi degli acidi nucleici e proteine, includendo l’elettroforesi su agarosio e su poliacrilammide e attraverso blotting (Southern, Northern e Western Blotting), nonché i diversi campi di applicazione di queste tecniche.
Viene descritto sia il processo di costruzione, che di analisi delle genoteche genomiche, di cDNA e di espressione, ponendo l’accento sulle informazioni ottenibili dal loro uso.
I progetti genoma relativi ad Arabidopsis thaliana e all’uomo vengono illustrati, spiegando i criteri di scelta degli organismi modello e le informazioni ottenute dalla conoscenza completa di tali genomi. Viene spiegata la differenza tra genomica strutturale, funzionale e comparativa, e illustrate le tecnologie proprie di ciascuna di queste branche, in particolare della strutturale (attraverso analisi delle genoteche genomiche per il sequenziamento di porzioni estese di DNA) e funzionale (attraverso le principali tecniche di analisi del trascrittoma e del proteoma).
Infine, viene presentato l’argomento relativo alle piante geneticamente modificate: come vengono realizzate attraverso i due sistemi principali (biolistico e Agrobatterio) illustrando vantaggi e svantaggi dell’uso di ciascuno, come si effettua un costrutto genico per l’espressione in pianta, quali sono le piante geneticamente modificate oggi presenti sul mercato, con accenni relativi alle problematiche inerenti all’accettabilità delle stesse.

Esercitazioni di laboratorio:
• Trasformazione batterica utilizzando un vettore plasmidico ricombinante, che viene estratto in una successiva esercitazione e caratterizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio
• PCR standard per determinare la presenza di uno specifico transgene in piante GM di frumento
• SDS-PAGE per analizzare la composizione proteica di cariossidi di frumento
• Uso dello spettrofotometro per determinare la quantità di DNA e proteine

Se il numero di studenti è superiore a 25, le esercitazioni vengono svolte in turni.

Brown T. 2017 (Zanichelli) Biotecnologie Molecolari
Diapositive del corso e altri materiali saranno messi a disposizione degli studenti dal docente sulla piattaforma Moodle

Le biotecnologie per il miglioramento delle produzioni vegetali
Cenni introduttivi sul ruolo delle biotecnologie applicate alle produzioni vegetali con riferimento all'ingegneria genetica, alle colture in vitro di cellule e tessuti, alle tecnologie per la diagnostica e la tracciabilità, allo studio della variabilità genetica per la filogenesi, la caratterizzazione varietale e la gestione del germoplasma, alle tecniche per la manipolazione di protoplasti e l'ottenimento di ibridi interspecifici.
Marcatori molecolari e analisi genetica
Concetto di marcatore genetico e introduzione all'analisi del polimorfismo molecolare.
I marcatori biochimici. I marcatori molecolari, ibridazione e PCR, marcatori RFLP e VNTR, marcatori RAPD, SCAR, CAPS, AFLP, SSR, ISSR, marcatori SNP.
Utilizzo di marcatori molecolari
Studi di genetica formale e sviluppo di mappe di associazione;
ricerca di marcatori associati a loci che controllano caratteri qualitativi e quantitativi;
clonaggio posizionale di geni mendeliani e QTL;
selezione assistita nel miglioramento genetico;
linkage disequilibrium e mappatura per associazione;
analisi della variabilità genetica, distanze genetiche e metodi di raggruppamento;
caratterizzazione varietale e analisi del flusso genico.
Argomenti delle esercitazioni
Ricerca in silico di marcatori microsatellite e individuazione di coppie di primer per amplificare la regione SSR.
Ricerca di single nucleotide polymorphisms da librerie di EST tramite allineamento di sequenze.
Allevamento di una popolazione F2 segregante marcatori morfologici e molecolari, fenotipizzazione, genotipizzazione (estrazione DNA, PCR, elettroforesi), analisi dei dati.

Testi di riferimento
Barcaccia & Falcinelli - Genetica e genomica Vol. III - Liguori editore.
Materiale didattico fornito durante il corso.