Docente
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PROIETTI Silvia
(programma)
Parte Teorica (32 ore) Manipolazione acidi nucleici e proteine e relativa analisi: Isolamento di DNA, RNA e proteine da campioni biologici; esempi ed applicazioni. DIGE. Tecniche per l'analisi dell'espressione genica: PCR semiquantitativa, competitiva, qPCR. Microarrays a cDNA e ad oligonucleotidi - analisi dati ed applicazioni. SAGE, librerie sottrattive. Analisi delle interazioni proteina-proteina: Tecniche di display in vitro: Protein Arrays, Far-Western, Pull-down, mRNA display e Ribosome display. Tecniche di display in vivo: Co-Immunoprecipitazione, Tandem Affinity Purification (TAP) system, Phage Display, Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC). Analisi delle interazioni DNA/RNA-proteina: Saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP e ChIP-on-chip). EMSA. Southwestern. Saggio del triplo ibrido in lievito. Metodi per lo studio delle modifiche epigenetiche: Tecniche basate sull’utilizzo di enzimi di restrizione sensibili alla metilazione: Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP). Conversione con bisolfito e successivi metodi di analisi: Bisulfite (non methylation)-specific PCR e Methylation-specific PCR (MSP): Analisi delle modifiche istoniche mediante ChIP. Tecniche di mutagenesi: Metodi di mutagenesi sito-specifica o casuale: mutagenesi per estensione di un primer, mutagenesi mediante PCR. Mutagenesi per ricombinazione: DNA shuffling.
Tecniche di genome editing: Zinc finger nuclease (ZFN), Transcription activator–like effector-based nuclease (TALEN) e CRISPR-Cas9 System. Applicazioni della PCR in campo diagnostico e forense. Sequenziamento del DNA. Progetto Genoma Umano. Next Generation Sequencing: piattaforme per il sequenziamento di seconda e terza generazione.
Parte Pratica (16 ore) Estrazione di RNA totale da foglie di Arabidopsis, quantificazione dell’RNA e analisi su gel di agarosio Estrazione di DNA genomico da foglie di Arabidopsis, quantificazione del DNA e analisi su gel di agarosio Estrazione di proteine idrosolubili da foglie di Arabidopsis e quantificazione dell’estratto proteico mediante il metodo Bradford. Purificazione in batch della proteina GST (Glutatione S-Transferasi) utilizzando biglie magnetiche coniugate a GSH . Analisi della proteina purificata.
(testi)
Brown T.A. Biotecnologie molecolari, principi e tecniche. Seconda ed., 2017, Zanichelli editore. Watson J.D., Caudy A.A., Myers R.M., Witkowski J.A. DNA ricombinante. Seconda ed., 2008, Zanichelli editore. Lesk A.M. Introduzione alla Genomica. Prima ed., 2009, Zanichelli editore.
Slides illustrate a lezione e disponibile sulla piattaforma didattica. Per le attività pratiche di laboratorio vengono fornite dispense dal docente. Gli studenti non frequentanti sono incoraggiati a contattare il docente per avere informazioni sul programma, sui materiali didattici e sulle modalità di valutazione del profitto.
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